Micron Document
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32P-Postlabeling
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Beim 32P-Postlabeling handelt es sich um eine Methode zum Nachweis von DNA-Addukten.

Contents

β€’ Einzelschritt
β€’ Enzymatische Hydrolyse
β€’ Adduktanreicherung
β€’ Phosphorylierung
β€’ Trennung und Nachweis
β€’ Literatur

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Einzelschritt

Enzymatische Hydrolyse

Im ersten Schritt erfolgt eine enzymatische Hydrolyse der DNA mittels Nuklease und Phosphodiesterase. Als Produkte entstehen 3'-Monophosphate. Enthielt die DNA DNA-Addukte, so entsteht ein Gemisch aus Addukten und adduktfreien Nukleotiden.

Adduktanreicherung

Die Anreicherung ist fakultativ, erhΓΆht jedoch die Empfindlichkeit. In einem zweiten Schritt spaltet eine selektive P1-Nuklease das 3'-Phosphat von den normalen Nukleotiden ab. Die durch Addukte modifizierten Nukleotide sind abbauresistent, so dass es zu einer Anreicherung kommt.

Alternativ ist es auch mΓΆglich, mittels n-Butanol-Extraktion die Addukte mit hydrophober Struktur zu extrahieren und somit anzureichern.

Phosphorylierung

Zur Markierung der Nukleotide wird durch T4-Polynukleotid-Kinase ein radioaktiver Phosphatrest von [Ξ³-32P]-ATP auf die Nukleotide im Ansatz ΓΌbertragen. Es entstehen Desoxyribonukleosid-3'-[5'-32P]-bisphosphate.

Trennung und Nachweis

Mittels mehrdimensionaler DΓΌnnschichtchromatographie und Szintillation bzw. mittels HochleistungsflΓΌssigkeitschromatographie (HPLC) kann nun der Nachweis erfolgen. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Addukt auf 1010 N.

Literatur

β€’ Ramesh C. Gupta: Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen: DNA Adducts. in: Cancer Research, 45, 5656–5662, November 1985, (PDF).
β€’ M. V. Reddy und K. Randerath: Nuclease P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. in: Carcinogenesis 7(1986) 1543–1551. PMID 3017601
β€’ D. H. Phillips: Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. in: Mut. Res., 378(1997) 1–12. PMID 9288880
β€’ K. Randerath und E. Randerath: P-32 postlabeling methods for DNA adduct detection - overview and critical-evaluation. in: Drug Metab. Rev., 26(1994) 67–85. PMID 8082582
β€’ K. Randerath, M. V. Reddy und R. C. Gupta: 32P-labelling test for DNA damage. in: PNAS, 78(1981) 6126–6129. PMID 7031643
β€’ A. Weston: Physical methods for the detection of carcinogen-DNA adducts in humans. in: Mut. Res., 288(1993) 19–29. PMID 7686262
β€’ A. Weston und M. C. Poirier in H. A. Milman und E. K. Weisburger (Editors): β€žHandbook of Carcinogen Testingβ€œ.

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